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本Fluo-4 AM(钙离子荧光探针)是配制于无水DMSO (anhydrous DMSO)中的储存母液，浓度为2mM。用于细胞内钙离子检测时，Fluo-4 AM的常用浓度为0.5～5μM。通常用含有0.5～5μM的Fluo-4 AM的适当溶液和细胞一起在20～37℃孵育10～60分钟进行荧光探针装载，随后适当洗涤，洗涤后可以考虑适当再孵育20～30分钟以确保Fluo-4 AM在细胞内充分转变成Fluo-4。

Fluo-4 AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。Fluo-4 AM将Fluo-3 AM结构中的氯原子替换成了氟原子，导致它的最大激发波长会向短波长处偏离10nm左右。这个波长更接近于氩激光器的波长488nm，所以用氩激光器激发时，Fluo-4的荧光强度会比Fluo-3强一倍。由于Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3相近，所以使用上和Fluo-3基本相同，可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。

Fluo-4 AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，能够穿透细胞膜进入细胞中。Fluo-4 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。

• Fluo-4 AM遇水极易分解，建议第一次使用时，母液分装并密封保存，同时注意保持干燥。
  
• Fluo-4 AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20～25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
  
• 探针的工作浓度、细胞量、孵育温度和时间等需要根据不同实验预先摸索。
  
• 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
  
• 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• (可选步骤)向本产品中加入20.6mg Pluronic F127(Pluronic F127可以防止Fluo-4 AM在HBSS中聚合并能帮助其进入细胞。
  
• 用HBSS稀释Fluo-4 AM溶液，制备0.5～5μM的Fluo-4 AM工作液。
  
• 将Fluo-4 AM工作液加入细胞，在37℃培养20分钟。
  
• 加入5倍体积的含有1%胎牛血清的HBSS，再继续培养40分钟。
  
• 用HEPES缓冲液(10mM HEPES，1mM Na2HPO4，137mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl2，0.5mM MgCl₂，5mM glucose，0.1% BSA，pH7.4)洗涤细胞3次，然后用HEPES缓冲液使细胞重新悬浮，制成1×10⁵cells/mL的溶液。
  
• 37℃下培养10分钟，然后用该细胞进行荧光钙离子检测。激发波长494nm，发射波长516nm。
  *标记的条件因细胞种类而异，在每次实验前，请先确定最佳条件。以上方法仅供参考。